1) Optische Visualisierung der Aktivität mechanosensitiver Ionenkanäle auf Einzelmolekülebene
Mechanosensitive Ionenkanäle wurden als primäre molekulare Wandler mechanischer Kräfte identifiziert, die an verschiedenen physiologischen Prozessen wie Berührung, Hören, Blutdruckregulierung und Knochenentwicklung beteiligt sind. Es ist bekannt, dass fehlerhafte mechanosensitive Ionenkanäle zur Pathologie von Krankheiten wie Herzfunktionsstörungen und Osteoarthritis beitragen (siehe Nobelpreis für Physiologie und Medizin 2021).
In einer unserer neueren Arbeiten (Wang et al., 2022) konnten wir mit Hilfe der Einzelmolekül-TIRF-Mikroskopie die laterale Mobilität und die Ionenkanalaktivität eines multi-Subunit Proteinkomplexes (TOM, auch bekannt als allgemeiner Proteinimportanal von Mitochondrien) in Membranen optisch verfolgen und korrelieren.
Wir fanden heraus, dass frei diffundierende TOM-Moleküle in ihrer Bewegung stoppen, wenn sie mit an die Membran angrenzenden Strukturen interagieren, was offenbar auf die Wechselwirkung zwischen ihren verlängerten polaren Domänen und Strukturen unterhalb der Membran zurückzuführen ist. Überraschenderweise und gleichzeitig mit der Unterbrechung der Bewegung wechselt TOM reversibel von einem aktiven (vollständig hellen) zu einem schwach aktiven (mittelhell) und inaktiven (dunkel) Kanalzustand. Die zeitliche Korrelation zwischen lateraler Mobilität und Ionenpermeabilität deutet darauf hin, dass das TOM-Kanal-Gating sehr empfindlich auf molekulares "Confinemnt", also die Art der lateralen Diffusion, reagiert.
TOM scheint somit nicht nur auf biochemische Signale, sondern auch auf mechanische Interaktionen zu reagieren. Zusammen mit der kürzlich bestimmten nahezu atomaren Kryo-Elektronenmikroskopie-Struktur von TOM (Bausewein et al. 2017) deuten unsere Ergebnisse auf mechanoregulatorische Prozesse in Mitochondrien hin, die bisher nicht erwartet wurden.
Ziel der Arbeit:
Ziel dieser Bachelor- bzw. Masterarbeit ist es, dieses Ergebnis weiter zu bestätigen, indem die mechanosensitiven Eigenschaften von TOM mit denen bekannter mechanosensitiver Ionenkanäle wie dem bakteriellen MscL und PIEZO1 verglichen werden.
Methoden:
- Isolierung von MscL und möglicherweise PIEZO1
- Proteinexpression in E. coli
- Einzelmolekül-TIRF-Mikroskopie
- Matlab
Referenzen:
- https://bioengineeringcommunity.nature.com/posts/optical-single-channel-recordings-reveal-correlation-between-lateral-protein-diffusion-and-channel-activity-of-tom
- https://www.nature.com/articles/s42003-022-03419-4
Kontakt und weitere Informationen:
shuo.wang@bio.uni-stuttgart.de
stephan.nussberger@bio.uni-stuttgart.de
2) Regulierung der pro-apoptotischen Aktivität des BCL2-Proteins BAX
Die durch Proteine der Bcl-2 Familie regulierte Freisetzung von zytotoxischen Proteinen aus Mitochondrien gilt als Schlüsselereignis in der Apoptose. Dabei spielt BAX eine entscheidende Rolle. Neueste Ergebnisse zeigen, dass BAX mit einem Palmitinsäure-Rest modifiziert wird, was die Insertion des Proteins in die mitochondriale Außenmembran befördert. Damit einhergehend führt eine verstärkte Palmitoylierung von BAX zu einer erhöhten zellulären Sensibilisierung gegenüber unterschiedlichen Apoptose-Stimuli.
Aus diesen Beobachtungen ergeben sich neue Konzepte zur Bekämpfung von bösartigen Tumorzellen, in denen Palmitoylierung von BAX reduziert ist. Eine Fehlregulierung von BAX führt zu einer Reihe von Autoimmunerkramkungen (z.B. Multiple Sklerose) , neurodegenerativen Erkrankungen (Morbus Alzheimer und Parkinson) aber auch zu Krebs. Auch Viren (z.B. HIV) können das Gleichgewicht stören.
Im Rahmen der Arbeit soll der Regulationsmechanismus von BAX in die mitochondriale Aussenmembranen auf Grundlage einer laufenden Bachelorarbeit (Gabriel Alexander) zum Thema 2-Methoxyestradiol induzierten Apoptose von Knochen-Tumorzellen (Osteosarcoma) weiter untersucht werden.
Literatur:
- 2-Methoxyestradiol affects mitochondrial biogenesis and succinate complex flavoprotein subunit dehydrogenase A in osteosarcoma cancer cells. Gorska-Ponikowska, M., Kuban-Jankowska, A., Eisler, S., Perricone, U., Lo Bosco, G., Barone. G. & Nussberger, S. Cancer Genomics Proteomics 15: 73-89 (2018)
- 2-Methoxy estradiol reverses the pro-carcinogenic effect of L-lactate in osteosarcoma 143B cells. Gorska-Ponikowska, M., Kuban-Jankowska, A., Daca, A. & Nussberger, S. Cancer Genomics Proteomics 14: 483-493 (2017)
- S-palmitoylation represents a novel mechanism regulating the mitochondrial targeting of BAX and initiation of apoptosis. Fröhlich, M., Dejanovic, B., Kashkar, H., Schwarz, G. & Nussberger, S. Cell Death & Disease 5 e1057:1-9 (2014)
Methoden: Zellkultur (HEK 293 / Osteosarcoma ), Standardmethoden der Proteinbiochemie